107%

表 5 用 LTQ Velos 离子阱比 LTQ XL 离子阱能鉴定得到更多的信号转导蛋白

LTQ Velos 有更好的灵敏度

在复杂混合物中，由于低丰度的前体离子存在于宽动态范围的背景基质中，需要很好的灵敏度（很强的信号），而且需要好的选择性，目标离子的选择效率以及能应对复杂体系的采集速度。 LTQ Velos 质谱仪对于在高度复杂背景下关键低丰度蛋白的检测有更好的灵敏度。用 Proteome Discovery 软件对检索得到的蛋白结果进行注释，如功能，亚细胞位置等。这些信息来源于公共的蛋白数据库（如 Swissprot 和 NCBI ） , 在 180 分钟的梯度运行一次目标样品，将检索到的蛋白进行分类， LTQ Velos 双压离子阱比 LTQXL 多检出了 133% 的信号转导蛋白，而且多检测了两倍数目的激酶和磷酸酶。

此外，只有 LTQ Velos 双压离子阱鉴定到了低丰度的的转录因子 ntl-3 ，它主要参与生长调控，还鉴定到了 F4369 主要参与细胞定位。

为了进一步证明 LTQ Velos 双压离子阱对于分析低丰度化合物的能力，比如在组织或细胞里天然丰度较低的蛋白或肽段，样品被稀释了 50 倍，在两台线性离子阱上进行分析，由LTQ Velos 双压离子阱 鉴定得到的特异性肽段比 LTQ XL 多 152% ，主要是由于 LTQ Velos 双压离子阱有高灵敏的二级质谱鉴定能力，有更好的离子传输效率，对于弱的前体离子信号， LTQ Velos 双压离子阱能在有限的最大注射时间内传输更多的离子到阱内，因此提高了二级质谱的灵敏度， LTQ Velos 双压离子阱由较快的扫描速率，也增加了低丰度的前体离子被鉴定到的几率。

图 5 20ng 进样量 60 分钟的色谱梯度 LTQ Velos 双压离子阱比 LTQ XL 离子阱能增加对低丰度蛋白鉴定的量。

LTQ Velos 双压离子阱提高实验通量

快速的扫描速率，不但提高了仪器工作循环的次数，同时也缩短了色谱分离时间，提高了实验的通量，对于同一个复杂混合物， LTQ Velos 双压离子阱在 60 分钟内鉴定到的特异性肽段比 LTQ XL 离子阱在 180 分钟内鉴定到的还要多，因此，对于简单而又有宽动态范围（如胶条带）的混合物分析，可以显著提高其通量。对于某些需要多次重复的实验，如方法开发，或涉及生物样品重复的实验，用此仪器就非常方便快捷。同样对于定量试验，用 LTQ Velos 双压离子阱也具有很大的优势，因此它有较快的扫描速度，更多的扫描次数，可以对较窄的色谱峰进行多个数据点的采集，因此适用于超高压液相色谱分离和短运行时间的分析实验。

为什么四级杆飞行时间质谱仪（ Q-TOF ）仪器鉴定的蛋白较少

对来源于 Q-TOF 仪器的数据进行详细分析，一级质谱全扫描的谱图质量与 LTQ Velos 几乎相当，而且信噪比和谱图特征也很类似，而且 Q-TOF 有更好的质量准确度（在 1% 假阳性率鉴定到的肽的 RMS 有 9PPM ），结果显示，在一定的分析时间内如 60 分钟，对于肽段鉴定的实验来说，全扫描的灵敏度、动态范围、或质量准确度不是决定因素，扫描速率可能是一个决定性因素，随着分离时间延长，扫描速率影响不是特别大，但肽和蛋白鉴定数目也提高了，如图 3 所示。对于扫描速率的详细讨论，请参考下面的 Q-TOF 扫描速度对灵敏度的影响。

由 LTQ Velos 双压离子阱鉴定到的前 20 个蛋白的 Mascot 平均得分为 1113.4 ，在 3Hz 扫描速度工作下的 Q-TOF 前 20 个蛋白平均得分为 506.7 ，前者是后者的一倍还多。 Q-TOF 的二级质谱图质量较差，导致了较少的肽段被鉴定到。 Q-TOF 一级质谱和二级质谱的高质量准确度并没有弥补低质量的二级质谱谱图。如，与线性离子阱获得的质谱图相比，有较少的序列离子，当检索参数设置为 MS1.4Da MS/MS 0.8 ，离子阱的二级质谱扫描谱图质量已经够高，结果显示，线性离子阱（ LTQ ）系统比四级杆 - 飞行时间（ Q-TOF ）在蛋白鉴定更具优势。

图 6 1ug C.elegans 蛋白胰酶酶解物在反相色谱分离的基峰图，四级杆飞行时间质谱和 LTQ Velos 线性离子阱全扫描动态范围的比较

Q-TOF 扫描速率对灵敏度的影响

如图 7 所示，将 Q-TOF 扫描速率从 3Hz 升至 6Hz ，导致鉴定到肽段数目减少，这主要是因为随着 Q-TOF 质谱仪的扫描速率提高，一级质谱图特别是二级质谱图质量下降。增加的扫描速度减少了离子的传输时间，由于较少的离子被检测到和平均化，因此降低了谱图的信噪比。如图 8 所示，将 Q-TOF 扫描速率从 3Hz 升至 8Hz ，损失了 66% 的 Q-TOF 信号，在二级质谱图可检测到的特征离子数目减少了。

增加的 MS/MS 采集的扫描速率，降低了二级质谱图的质量和信噪比，而且 Mascot 鉴定到的肽段的得分也受影响，如图 9 所示，二级质谱图扫描几乎来源于色谱峰的顶点。在高质量 Q-TOF3Hz 谱图下， Mascot 得分为 49 分，而且 LTQ Velos 双压离子阱对于同一样品，进样量只有 Q-TOF80% 的时候， Mascot 的得分为 103 分，前者比后者低了 53% ，当 Q-TOF 在 6Hz 运行时，对于 1 μ g 的样品在 180 分钟的运行时间内，鉴定到的肽段数目下降了 40% ，这就是为什么尽管仪器的扫描速率可以达到 10Hz ，在做肽段鉴定实验过程中，厂家不建议其采样速率超过 3Hz 的原因。

拥有专利技术的 pAGC ，在阱内可实现离子累积， LTQ Velos 双压离子阱不管前体离子的峰强度，对于二级质谱的离子数目进行优化，结果显示，在 180 分钟的梯度内，在实际扫描速率为 6.3Hz 运行下的 LTQ Velos 双压离子阱比 6Hz 运行下的四级杆飞行时间质谱（ Q-TOF ）多检测到了 282% 个特异性肽段。

图 7 1ug C.elegans 蛋白胰酶酶解物在 180 分钟内用四级杆 - 飞行时间质谱仪（ 3Hz 和 6Hz ）和 LTQVelos 线性离子阱鉴定到特异性肽段数目的比较

图 8 在 Q-TOF 仪器上比较不同质谱扫描速率下信号的强度

图 9 四级杆 - 飞行时间质谱在两个不同二级质谱扫描速率下，对同一个二价前体离子 LVGDLDDAQVDVER 二级质谱图的比较。而 LTQ Velos 离子阱对同一前体离子检测只用了 80% 的样品量。

结论：在一个复杂的蛋白质组样品中，高灵敏的检测和鉴定化合物对于了解和认知动态蛋白质学具有极其重要的意义。随着技术的革新， LTQ Velos 双压线性离子阱质谱仪的出现，，大幅度提高了肽段和蛋白鉴定的个数，与当前主流的技术相比， LTQ Velos 双压线性离子阱质谱仪由于其超高的采集速度和高的灵敏度，增加了低丰度的前体离子的鉴定数目。

在一个复杂混合样品中， LTQ Velos 离子阱比四级杆 - 飞行时间质谱能多鉴定 240% 个蛋白质和 130% 个特异性肽段，而且，通过四级杆 - 飞行时间质谱鉴定到的蛋白，有 90% 以上都能在 LTQ Velos 看到。

LTQ Velos 双压线性离子阱对于低含量的物质有较高的灵敏度。上样量在 20ng 的时候，与 LTQ XL 离子阱相比， LTQ Velos 双压线性离子阱对于特异性肽段的鉴定增加了 150% 。

随着鉴定蛋白数目的增多， LTQ Velos 双压线性离子阱给出了更多的低丰度的蛋白，在这里面，对与信号转导蛋白的量提高了 133% 。

LTQ Velos 双压线性离子阱提高了实验的通量，对于复杂样品的分离，比 LTQ XL 离子阱在三分之一的分离时间里，鉴定了更多的蛋白和肽段。

相比四级杆 - 飞行时间质谱仪，在线性离子阱中能得到更高质量的二级质谱图，这样在 Mascot 检索中能得到更高的分数。通过四级杆 - 飞行时间质谱仪得到高质量准确度的图对于肽段的鉴定是有益的但还不够。

提高四级杆 - 飞行时间质谱仪的扫描速度会降低一级质谱和二级质谱图的信号和谱图质量，同时导致减少鉴定到肽段的数目。

参考文献

Horn, D.M., Miller, C.A. , Miller, B.D. The Effect of MS/MS Fragment Mass Accuracy on Peptide Identification in Shotgun Proteomics. Application Note 5989-7820 EN. www.agilent/chem/proteomics

感谢

感谢华盛顿大学基因科学系 Gennifer Merrihew 提供 C.elegans 样品。
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